我国科学家提出性染色体“四阶段”演化假说
性染色体的演化是生物学的一个核心谜题，为什么不同动物会形成不同的性别决定系统？8月28日，浙江大学生命演化研究中心张国捷团队和中国科学院昆明动物研究所施鹏团队在著名学术期刊Science（《科学》）发表了基于壁虎的研究成果，尝试回答了这一问题，并提出了性染色体的“四阶段”演化假说。
壁虎拥有极为独特的性别决定多样性
人类性别由XY型性染色体来决定，女性是XX，男性是XY。
性染色体之所以能够决定性别，是因为这条染色体上有与性别决定有关的基因。
实际上，动物的性别决定系统十分多样。
以爬行动物为例，棱皮龟等海龟的性别并非由性染色体决定，而是取决于孵化温度。
通常，龟类在较高孵化温度下发育为雌性，较低温度下则发育为雄性。
但也有一些物种恰好相反，例如豹纹守宫和鬣蜥等蜥蜴类爬行动物，它们在较高孵化温度下更易产生雄性，而雌性则多出现于较低孵化温度条件下。
还有一种情况是，在鸟类、部分蛇和蜥蜴中，存在雌性杂合型的ZW性别决定系统。
它们的性染色体被称为Z染色体和W染色体，与XY型性别决定正好相反：同配子性别（ZZ）的个体发育成雄性，异配子性别（ZW）的个体发育成雌性。
同样都是性染色体决定性别，为什么有些物种用XY系统，有些用ZW系统？我国科学家在壁虎身上找到了新答案。
人们对壁虎的普遍印象，多半源于其脚趾上特殊的吸附构造所带来的卓越攀爬能力，以及断尾再生的生存绝技。
然而，多数人不了解的是，壁虎在整个硬舌亚目中拥有极为独特的性别决定多样性，既存在温度依赖型性别决定系统，也同时囊括XY型和ZW型两种遗传决定系统。
专家介绍，这种多样性涵盖了从近期才起源的性染色体到古老的高度分化的性染色体，为研究驱动性染色体演化的动因提供了很好的材料。
为了探究其中的演化机制，浙江大学生命演化研究中心张国捷团队选择了22种壁虎物种进行研究，其中20个物种有明确的性别决定方式，3种温度依赖型、6种XY型、11种ZW型。
这些物种涵盖了目前已知所有壁虎科中约70%的独立性染色体起源事件，能较为完整地反映这个类群中性别决定机制的多样性。
研究回溯了壁虎的演化历程，推测出壁虎的祖先是在大约1.91亿年前与其他所有蛇类及蜥蜴分离，并且在白垩纪大灭绝事件前后经历了快速的辐射演化。
研究重建了壁虎最近共同祖先的38条染色体，并发现其祖先没有性染色体，很可能是由环境依赖型性别决定的。
研究分析的物种间的演化关系。
性别决定系统标注在物种树叶节点，其中橙色为ZW型性别决定，浅蓝色为XY型性别决定，灰色为温度依赖型性别决定，空心为性别决定类型不明。
浙江大学生命演化研究中心张国捷团队制图
壁虎性染色体演化与气候转折相关
研究发现，20个由基因型性别决定壁虎物种的性染色体，分别源自17条不同的祖先染色体；而即使是由同一个祖先染色体演化而来的性染色体，在不同的壁虎类群中，其性别分化区域也不同。
专家指出，这表明这些祖先染色体在不同谱系中分别独立演化，形成了各自的性染色体。
壁虎的性染色体类型极其多样，几乎如同在不同谱系中被反复“重新发明”一般。
序列分析进一步显示，各物种性染色体的演化年龄新老并存，这一差异再次印证了其多次独立起源的历史。
另一个值得关注的发现是，尽管研究涉及的壁虎物种中，性染色体的演化年龄跨度极大，年代最久远的可追溯至约5445万年前，而较年轻的不足600万年，但历史上存在一个特殊的集中形成期——研究发现，有相当数量的物种性染色体集中涌现于1200万至700万年前这一时间段内。
这500万年的窗口期，恰好对应地球历史上的中新世中期气候转变期。
当时，全球经历了显著降温、干旱化和栖息地破碎化，对生态系统产生了深远影响。
这一古气候事件与众多脊椎动物谱系的生物地理重组密切相关，提示该时期的环境变化，尤其是气温的波动，可能施加了推动物种从温度依赖型性别决定向基因型性别决定转变的选择压力，最终在多个壁虎谱系中引发了这场同步发生的“性染色体诞生潮”。
如果说壁虎性染色体的出现时间存在某种规律，那么另一个更加耐人寻味的问题则是：为什么有些壁虎演化出了XY型性别决定系统，而另一些却走向了ZW型？换句话说，当一条常染色体被转变为性染色体时，它为什么会选择不同的演化方向？
通过转录组的分析，研究团队意外地发现，祖先基因组成与性染色体的演化方向相关。
如果性染色体的祖先染色体上具有较多的睾丸偏好性表达基因时，它会倾向于向Z染色体演化，形成ZW型性别决定系统；反之，如果祖先染色体上这类基因比例较低，该染色体会倾向于向X染色体演化，形成XY型性别决定系统。
为了确定这一规律的适用范围，研究团队对更多动物类群进行了分析，涵盖了主要脊椎动物谱系中的39个物种，覆盖了爬行动物、哺乳动物和鸟类等羊膜动物中的15次独立的性染色体起源和非羊膜动物中的24次独立性染色体起源。
分析显示，上述规律同样适用于羊膜动物中，但祖先染色体的基因表达偏好对非羊膜动物的两栖动物和鱼类的性别决定系统选择影响较弱，这可能与这类生物主要是在体外受精并产生大量配子，从而减弱相关选择压力有关。
环境与基因组共塑性别决定多样性
性染色体分化带来的另一个重要问题，是如何避免两性之间出现基因剂量失衡。
当Y或W染色体丢失部分基因后，异配子性别（XY雄性或ZW雌性）可能只有一份相关基因拷贝，而另一性别拥有两份。
研究团队通过比较同配子性别与异配子性别在多种体细胞组织中性染色体基因的表达水平，发现大多数基因型性别决定（GSD）的壁虎都至少呈现出了部分剂量平衡状态，其X:XX（或Z:ZZ）表达比通常介于0.5至1之间，而有三种壁虎则表现出完全剂量平衡，两性间基因表达水平高度一致。
然而，与上述的退化程度与性染色体年龄呈正相关不同的是，剂量平衡程度与性染色体年龄并无相关性，且XY与ZW系统之间亦无显著差异。
这种模式甚至在具有同源性别分化区的物种中依然存在。
进一步的分析表明，壁虎体内的剂量补偿调控机制并非通过同配子性别中的基因下调实现，而是通过异配子性别的基因上调来发挥作用。
这一调控方式与鸟类和蛇类中的发现一致，表明在剂量补偿中，异配子性别表达上调是一种演化上普遍存在的调控机制，能够在不同物种间独立产生。
性染色体演化的“四阶段走”模型。
浙江大学生命演化研究中心张国捷团队制图
基于这些发现，研究团队尝试回答一个更大的问题：一套新的性别决定系统，究竟是如何诞生并稳定下来的？为此，他们提出了一个关于性别决定系统演化的“四阶段”模型，将气候变化、基因组成以及长期演化过程串联成一个完整的故事。
第一阶段，环境驱动。
剧烈的气候变化使依赖温度的性别决定面临风险，基因型性别决定因更具稳定性而获得优势，推动系统从“看天”转向“看基因”。
第二阶段，倾向性演化。
某条常染色体被“选中”后，其原有的基因组成已暗含未来方向——偏向睾丸表达的基因含量多则预示ZW路径，反之走向XY路径。
第三阶段，渐进分化。
通过重组抑制，性染色体逐步分化，形成X与Y（或Z与W）的差异。
第四阶段，稳定锁定。
Y或W持续退化，剂量补偿机制协同演化，形成牢固的进化约束。
此后更换性别决定系统的代价极高，多数物种因此长期维持现有系统。
专家解释，这一模型将全球气候变化、基因组特征以及染色体演化过程联系在一起，描绘出性染色体从诞生到稳定的完整历程。
它也提示，脊椎动物中丰富多样的性别决定方式，或许并不是演化过程中完全偶然的产物，而是在环境压力与基因组特性共同作用下形成的结果。
新京报记者 张建林
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哺乳动物骨髓染色体畸变试验是一项体内遗传毒性检测方法，用于评价受试物经吸收、代谢后对啮齿类动物骨髓细胞染色体结构的损伤效应。本文围绕试验对象与适用范围、动物分组与染毒设计、骨髓采集与制片、镜检判读、仪器条件、标准依据以及阳性结果判定等内容展开说明，为委托方在方案设计与结果解读阶段提供参考。
哺乳动物骨髓染色体畸变试验对象 该试验的检测对象是受试物在活体内诱导骨髓细胞中期染色体发生结构畸变的能力。
常见送检物包括食品添加剂、新食品原料、化妆品原料、农药原药与制剂、日用化学品、消毒产品以及药物候选物。
试验系统首选健康性成熟的啮齿类动物，小鼠和大鼠使用最多，骨髓因细胞更新快、分裂相丰富而成为取材组织。
检测终点覆盖染色单体型畸变与染色体型畸变两大类。
前者包括单体断裂与单体交换，后者包括断片、缺失、环状染色体、双着丝粒体与易位等。
在安全性毒理学评价程序中，本试验通常与细菌回复突变试验、微核试验组成评价组合，用于判断受试物有无致突变风险。
试验动物分组与染毒设计 动物经检疫适应后进入试验，一般选用小鼠或大鼠，雌雄各半，每组可分析动物数量需满足统计学要求。
试验设阴性对照组、阳性对照组以及至少三个受试物剂量组，阳性对照常选用环磷酰胺等已知断裂剂。
高剂量原则上取最大耐受剂量或限度剂量，限度剂量为2000 mg/kg体重/日，同时应避免动物出现严重毒性或死亡。
染毒途径首选经口灌胃，也可依据实际暴露方式选择腹腔注射或经皮途径。
染毒方案分单次染毒与连续多次染毒两类，末次染毒后的采样时间约为1.5个细胞周期，并常增设间隔约24小时的第二采样点。
剂量组数量、采样点多少与动物品系决定了试验规模，也是送检方核算费用的主要变量。
骨髓采集与染色体制片流程 采样前数小时，动物需腹腔注射秋水仙素或秋水仙酰胺，使骨髓细胞阻滞于分裂中期。
随后按既定时间点安乐处死动物，进入制片环节。
制片操作在洁净条件下连续完成，主要步骤如下： 剥离股骨并剪去两端，用生理盐水冲出骨髓腔内细胞； 离心收集细胞，以0.075 mol/L氯化钾溶液进行低渗处理； 以甲醇与冰醋酸按3:1配制的固定液反复固定； 将细胞悬液滴于预冷洁净载玻片上，自然干燥； 吉姆萨染液染色，晾干后封片备检。
低渗与固定效果直接决定染色体的分散度与形态清晰度。
制片不良会造成分裂相丢失或重叠，这类玻片应在镜检前剔除并重新制片。
镜检分析与畸变类型判读 阅片在油镜下进行，玻片经盲法编号后由分析人员独立读片，必要时安排双人复核。
每只动物通常分析不少于100个分散良好的中期分裂相。
分析时先核对二倍体数目是否正常，小鼠为2n=40，大鼠为2n=42，再逐相记录畸变类型。
判读环节中，裂隙单独统计，不计入畸变率；多倍体与内复制细胞另行记录。
除结构畸变外，每只动物还需计数约1000个细胞中的分裂相比例，即分裂指数，用于评估受试物对骨髓细胞的毒性抑制程度。
畸变细胞数与畸变类型分别汇总，构成统计与判定的原始数据。
仪器设备与环境条件 试验涉及的设备均为通用类型，包括生物显微镜与油镜镜头、显微成像及染色体分析系统、低速离心机、恒温水浴设备、分析天平以及动物解剖器械。
动物饲养区域需具备屏障设施，维持规定的温度、湿度与洁净度，保证试验期间动物状态稳定。
试剂方面，秋水仙素类阻滞剂、低渗盐溶液、固定液与吉姆萨染液需按规范配制，并在规定期限内使用。
玻片、载玻片清洗与染色条件的一致性，直接影响不同批次数据之间的可比性。
试验标准与技术规范 我国食品领域执行GB 15193.6—2015《食品安全国家标准 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验》，对动物、剂量、采样与判定的技术要求作出了规定。
国际层面对应OECD化学品测试指南OECD TG 475，其2016年修订版更新了剂量上限与数据判定条款。
化妆品原料评价可参照《化妆品安全技术规范》（2015年版）中收载的体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验方法，农药登记则依据我国农药登记毒理学试验方法相关标准开展。
用于药品注册或涉及申报的检测时，试验一般应在符合药物非临床研究质量管理规范的条件下实施。
原始记录、玻片留存与数据归档需满足可追溯要求，以备评审与核查。
结果评判与阳性判定标准 一批数据可予采纳的前提包括两点：阴性对照组的畸变率落在实验室历史背景数据范围内；阳性对照组畸变率明显升高，能证明试验系统敏感。
任一前提不成立，本批数据即判为无效，需查明原因后重做。
阳性结果的判定依据包括两类情形。
其一，某一剂量组的畸变细胞率经统计学检验高于阴性对照，并超出历史背景数据范围。
其二，畸变率随剂量增加而升高，呈现剂量—反应趋势。
常用统计方法包括卡方检验、Fisher精确检验与趋势检验，统计学结论需与生物学意义结合判断。
当剂量相关性不明确，或仅个别剂量组出现边缘升高时，结果判为可疑，应调整剂量间距或采样时间后重复试验。
报告一般载明动物信息、染毒方案、各组畸变细胞数与畸变类型构成、分裂指数以及统计结论，供评价方审阅。
与体外染色体畸变试验区别 OECD TG 473对应的体外哺乳动物细胞染色体畸变试验，以离体培养细胞为材料，需分别设置加与不加代谢活化系统的处理条件，可在短期内完成大批量样品的初筛。
体内骨髓试验则覆盖吸收、分布、代谢与排泄的完整过程，更能反映受试物在整体状态下的遗传毒性表现。
两类试验观察终点相近而定位不同。
常规评价策略是先以体外试验初筛，阳性或存疑物质再进入体内试验确认。
与同属体内试验的微核试验相比，骨髓染色体畸变试验直接观察中期相的结构异常，信息维度更细；微核试验以微核率为终点，两者在组合评价中互为补充。
常见问题与解答 哺乳动物骨髓染色体畸变试验的检测费用主要受哪些因素影响？ 费用与试验规模直接相关。
动物品系与数量、剂量组数目、采样点多少、对照品设置以及每只动物需分析的分裂相数量，共同决定饲养、染毒、制片与阅片的工作量，不同项目的报价因此存在差异。
哺乳动物骨髓染色体畸变试验结果存疑时如何复检？ 剂量相关性不明确或仅个别剂量组边缘升高时，结果判为可疑，应调整剂量间距或采样时间后重复试验；对照数据不成立时本批结果无效，需查明原因重做。
对数据有异议，可调阅盲法阅片原始记录并安排双人复核。
哺乳动物骨髓染色体畸变试验的周期与报告交付包含哪些环节？ 试验周期由动物检疫适应、染毒、两个采样点的间隔、制片、镜检分析与统计汇总等环节构成，具体时长以检测机构方案为准。
报告内容一般包括动物信息、染毒方案、各组畸变细胞数与畸变类型构成、分裂指数及统计结论。
